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人iPS細胞基因編輯解決方案,Disease model in a dish
 
人誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs) 具備多向分化潛能和自我更新能力,同時可保留細胞來源個體的遺傳背景。結合CRISPR/Cas9基因編輯技術,可以打造肝臟、心臟、神經等多種疾病模型,進行遺傳變異的功能性研究以及更深遠的再生醫學研究。
Takara提供多款工具,針對性解決人iPS細胞基因編輯關鍵操作和挑戰。
 
關鍵操作之基因編輯人iPS細胞
 
CRISPR/Cas9基因編輯技術的兩個組件(Cas9核酸酶和sgRNA)可以通過多種方法導入至靶細胞,如載體表達系統,RNA轉染系統,或直接導入Cas9/sgRNA核糖核蛋白(RNP)復合物(Sander and Joung 2014)。與載體表達系統相比,直接導入Cas9/sgRNA RNPs更加快速,同時脫靶效應的可能性更小 (Kim et al. 2014)。
 
對于難轉染的人iPS細胞,Takara提供兩種Cas9/sgRNA RNPs導入方法,電穿孔Electroporation法或納米囊泡Gesicle法,實現高效的、低脫靶效應的基因編輯。
一、電穿孔法基因編輯
· Guide-it™ sgRNA In Vitro Transcription Kit (Code No. 632635; 1 kit)
· Guide-it™ Recombinant Cas9 (Electroporation-Ready) (Code No. 632641; 100 μg)
二、Gesicle法基因編輯
· Guide-it™ CRISPR/Cas9 Gesicle Production System (Code No. 632613;1 kit)
 
關鍵操作之獲得所需突變的單細胞克隆
 
 
一旦Cas9/sgRNA RNP復合物被導入, 為了分離和篩選感興趣的基因型,需要進一步分離成單細胞并擴增為單克隆。傳統的人iPS 細胞以集落狀生長和傳代,不利于進行單細胞分離和單細胞培養,為基因編輯后建立單克隆增加了難度。
 
Takara旗下的DEF-CS 培養系統(Asplund et al. 2016),支持人多能干細胞無血清,無飼養層,單層均勻、非集落狀生長,規避了集落狀生長帶來的挑戰,允許單細胞傳代和促進接種后的單細胞存活和擴增,更利于獲得基因編輯后感興趣突變的單克隆。建議使用Y30010進行人iPS細胞常規培養,使用Y30021進行人iPS細胞單克隆培養。
 
Code No. Product Size
Y30010 Cellartis® DEF-CS 500 Culture System 1 Kit
Y30021 Cellartis® iPSC Single-Cell Cloning DEF-CS Culture Media Kit 1 Kit
 
參考文獻:
· Asplund, A. et al. One Standardized Differentiation Procedure Robustly Generates Homogenous Hepatocyte Cultures Displaying Metabolic Diversity from a Large Panel of Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. Reports 12, 90–104 (2016).
· Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J. & Kim, J.-S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24, 1012–9 (2014).
· Sander, J.-D. & Joung, J.-K. CRISPR-Cas9 systems for genomic editing, regulation and targeting. Nat. Biotechnol. 32, 347–55 (2014).
 
實驗案例:
1. 在人iPS細胞的內源性基因插入AcGFP1標簽
Tagging an endogenous gene with AcGFP1 in hiPS cells
 
 
2. 在人iPS細胞內源性基因插入myc標簽
Tagging an endogenous gene with a myc tag in hiPS cells
 
3. 人iPS細胞敲除內源性基因CD81
Knocking out an endogenous gene (CD81) in hiPS cells
 
4. 在人iPS細胞內引入酪氨酸血癥相關SNP
Introducing a tyrosinemia-related SNP in hiPS cells
 
5. 在人iPS細胞的AAVS1位點插入表達框
Inserting an expression cassette into the AAVS1 locus in hiPS cells
 
6. 使用電穿孔法編輯人iPS細胞
Editing hiPS cells using electroporation
 
7. 建立人iPS細胞的單細胞克隆
Single-cell cloning of hiPS cells

 
 
 
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