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悟了,要想微生物組測序不難搞,選對方法很關鍵!
 
微生物雖然微小,但不可否認的是它們無處不在,與人類有著十分密切的關系。一方面我們與很多微生物和諧相處,比如腸道益生菌。而另一方面大量的病原微生物也給人類的健康甚至生命帶來了巨大的威脅。因此,我們對微生物的研究始終都未曾停止過。

主要的研究方法包括經典的培養鑒定法、血清學檢測、微生物核酸檢測(如RT-PCR法)以及NGS分析等多種方法。其中相較于傳統方式,NGS技術可以對疑難微生物以及難以培養的菌屬進行核酸序列的測定(特別是在新型病原微生物流行監測方面),并且在檢測時間、通量上具有無可比擬的優勢,因此逐漸成為微生物研究領域的重要方法。
 
mNGS,也稱宏基因組測序技術,是研究環境或人體等樣本中所有以DNA為基因組的微生物遺傳物質的技術,它的發展開啟了微生物研究的新時代。這種技術不依賴微生物分離培養,可直接對臨床樣本中的核酸進行檢測,分析微生物群落、以及微生物與宿主之間的相互關系。
 
ThruPLEX DNA-Seq Kit,實現對微量樣品的可靠宏基因組分析
在某些情況下,以非常少量的臨床樣本作為研究對象進行宏基因組分析是難免的,這類樣本包括臨床拭子、體液、少量組織等。ThruPLEX DNA-Seq Kit支持50 pg-50 ng DNA起始,單管操作、手動15 min、總共兩小時,過程中無需轉管與純化,輕松應對宏基因組建庫難題!
 
■ 文獻案例
皮膚是人體最大的器官,“網羅”了各種各樣的微生物。多年來,雖然科研人員對涉及皮膚內穩態的微生物群落研究有了一些進展,但對皮炎與微生態失衡之間是否關聯知之甚少。瑞典卡羅林斯卡醫學院的Dr. Nanna Fyhrquist團隊在Nature Communications雜志上發表了題為Microbe-host interplay in atopic dermatitis and psoriasis的文章,采用宏基因組學結合16s rRNA測序、宿主轉錄組測序分析技術,探討過敏性皮炎、銀屑病及健康人皮膚表面微生物群落特征,并與宿主皮膚轉錄組數據進行關聯分析。
結果顯示,過敏性皮炎與銀屑病皮膚樣品具有各自特有的微生物群落特征,并都與健康人樣本的數據存在差異。其中,過敏性皮炎樣本的優勢菌為Staphylococcus aureus,與皮膚屏障功能、色氨酸代謝及免疫激活等宿主轉錄組數據有相關性;銀屑病樣本顯示出共生的微生物群落結構,并與宿主疾病相關基因的表達存在弱相關性。
 
盡管mNGS 用于病原微生物檢測具有諸多優勢,但其技術上往往還面臨著一些挑戰:比如,樣本中宿主(例如人源)核酸的干擾。由于宿主基因組大小很可能遠大于微生物的基因組,目標基因片段在整體樣本中的含量較低,不僅會導致檢測成本偏高,甚至會出現目標基因片段太小而無法正確鑒定的假陰性結果。

針對上述這種情況,可以選擇采用多重PCR(multiplex PCR)測序。在提高靈敏度的前提下,可以大大減少測序數據量,實現性能及成本的雙優化。

Tip: 多重PCR也稱復合PCR,它是在常規PCR基礎上改進并發展起來的一種新型PCR擴增技術。它的基本原理與常規PCR相同,區別在于多重PCR是在反應體系中加入了兩對以上引物,各對引物分別結合在模板相對應部位,最終擴增出兩條以上目的DNA片段。
 
>> 多重PCR測序的操作流程
 
>>多重PCR的優勢

·不受宿主基因組及背景菌影響:只對目標微生物進行檢測,PCR產物不包含宿主基因片段及背景菌群基因片段。
·實驗時間和成本雙雙降低:mNGS會對樣本中所有的核酸進行檢測,而多重PCR測序只需針對特異性擴增片段檢測,大大降低了檢測時間和成本。

 
但多重PCR要想實現較好的擴增性能,需要考慮反應多方條件,具有較高的技術壁壘,而其中多重PCR酶的選擇也是重中之重,所以這里“墻裂”推薦↓
 
Multiplex PCR Assay Kit Ver.2
它是由能快速進行Priming的酶與能很好提高引物退火特異性的反應液配套組成的Multiplex PCR用試劑盒。同以往Multiplex PCR Enzyme相比,可在短時間內特異性地進行無偏差的PCR擴增。另外,調整酶量和反應時間也可對大約200對引物進行Multiplex PCR。
 
■ 更加高效完成多重PCR反應的實驗例
皮膚是人體最大的器官,“網羅”了各種各樣的微生物。多年來,雖然科研人員對涉及皮膚內穩態的微生物群落研究有了一些進展,但對皮炎與微生態失衡之間是否關聯知之甚少。瑞典卡羅林斯卡醫學院的Dr. Nanna Fyhrquist團隊在Nature Communications雜志上發表了題為Microbe-host interplay in atopic dermatitis and psoriasis的文章,采用宏基因組學結合16s rRNA測序、宿主轉錄組測序分析技術,探討過敏性皮炎、銀屑病及健康人皮膚表面微生物群落特征,并與宿主皮膚轉錄組數據進行關聯分析。
結果顯示,過敏性皮炎與銀屑病皮膚樣品具有各自特有的微生物群落特征,并都與健康人樣本的數據存在差異。其中,過敏性皮炎樣本的優勢菌為Staphylococcus aureus,與皮膚屏障功能、色氨酸代謝及免疫激活等宿主轉錄組數據有相關性;銀屑病樣本顯示出共生的微生物群落結構,并與宿主疾病相關基因的表達存在弱相關性。
 
■ 多重PCR測序的實驗例
使用Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 和本產品、以人基因組DNA為模板對207個目的基因進行Multiplex PCR,制備文庫后進行NGS測序。
*The percentage of bases in all targeted regions (or whole genome) covered by at least 0.2× the average base read depth.
 
 
結果顯示,通過對約500萬reads進行測序,得到207個目的基因全部為500個reads以上,確認全部的目的基因可以被正確擴增!
 
 
我們相信,選擇合適的方法和試劑,會讓您的mNGS實驗事半功倍。
 
 
 
 
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