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Y2H+NGS,酵母雜交新思路!
 
眾所周知,酵母雙雜交技術 (Y2H) 是一種成熟的用于研究蛋白質-蛋白質相互作用的技術。為滿足當前解開復雜蛋白質互作網絡的需求,國內外學者通過對建立中高通量Y2H篩選平臺進行調整,已成功將Y2H與下一代測序 (NGS) 技術相結合,以此來增加篩選的規模和方法的靈敏度。今天,小編就帶您了解一下其中兩個方法。
 
方法一:rec-YnH
該方法能夠同時多對多檢測直接的蛋白質-蛋白質和蛋白質-RNA 相互作用。使用批量克隆、轉化與細胞內同源重組相結合的方法生成誘餌-獵物融合文庫,在液體凝膠中進行相互作用選擇,并通過使用基于 ORF 序列的下一代測序(NGS)驗證相互作用,消除了現有方法所需的費力鋪板等步驟,工作流程更加簡單且節省經費。
 
文獻案例
Lang, Benjamin, et al. "Matrix-screening reveals a vast potential for direct protein-protein interactions among RNA binding proteins." Nucleic acids research (2021): 6702-6721.
 
·背景
RNA 結合蛋白 (RBPs) 是轉錄后基因調控的關鍵因素,RBP從轉錄的初始時刻開始與 RNA 進行相互作用,指導 RNA 加工、核輸出、細胞質定位、翻譯和衰變等。RBP對于在時間、空間和細胞環境中引導基因表達至關重要,它的作用模式被深入研究,迄今為止,已經發現了數百個 RBP,并且已經研發了許多方法來了解哪些 RNA 與哪些 RBP具有相互作用以及互作位置。盡管如此,RBP-RNA 相互作用的決定因素仍然是一個具有激烈爭議的研究領域。
 
·方法
為了系統地尋找直接的RBP相互作用,作者組裝了一個含有978個哺乳動物RNA結合蛋白,76個微管相關蛋白(MAPs)的RBP庫,使用高通量重組酵母雙雜交(rec-Y2H)篩選來檢測1054個蛋白質之間>100萬個相互作用。
 
·說明
本文作者使用了Takara的Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System進行rec-Y2H分析,Matchmaker Gold酵母雙雜交系統用于研究蛋白質—蛋白質相互作用。系統是采用3個啟動子、4個報告基因共同篩選,有效降低假陽性!
 
·結論
最終檢測到1994種新的RBP相互作用, 同時驗證了422種以前報道的相互作用。還發現RBP的mRNA結合區域和基序偏好會因為他們相鄰的結合互作伙伴不同而有所不同,揭示了主要 RNA 加工步驟之間新的RBP相互作用網絡,并發現了在癌癥中觀察到的剪接損傷RBP突變重新連接剪接體相互作用網絡。這些數據有助于理解蛋白質-RNA 相互作用、RNA 代謝和基因表達的基本原理。
 
方法二:Y2H-seq
將Y2H篩選與下一代測序 (NGS) 相結合,可以減少工作量和成本,同時提高靈敏度,并且能夠快速識別所選生物體中感興趣的誘餌蛋白質的相互作用蛋白質。選定的誘餌蛋白質和數以千計的獵物蛋白質以陣列形式生長,分別配對匯集。NGS縮小了獵物池的范圍,最終通過選擇性培養基上的大規模斑點分析檢測相互作用。Y2H-seq 篩選方法生成定量讀數,通過控制篩選可以消除假陽性以提高特異性,從而可以減少下游一對一相互作用驗證實驗。此外,該方法依賴于 cDNA文庫,適用于所有生物體。
 
文獻案例
Chen, Xi, et al. "Determination of conifer age biomarker DAL1 interactome using Y2H-seq." Forestry Research (2021): 1-12.
 
·背景
年齡作為一種復雜的生理信號,可確保生物體不同發育階段的順序。對于針葉樹種,通常具有十分漫長的童期,且針葉樹具有明顯的年齡效應,無性繁殖困難,所以針葉樹年齡決定機制的全面解析至關重要。DAL1曾被鑒定為油松年齡標志因子,在油松從營養生長階段到生殖生長階段的過渡中起重要的作用,闡明與 DAL1 相關的相互作用是了解年齡如何驅動油松發育的關鍵。
 
·方法
作者開發Y2H-seq 方法,運用該方法對油松年齡標志因子DAL1互作蛋白進行了大規模篩選。
 
·說明
在 Y2H 檢測中,使用了TakarapGBKT7 (DNA-BD) 和 pGADT7 (AD)載體;用于構建誘餌蛋白質PtDAL1 和不同年齡段油松cDNA文庫;這兩個載體作為Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System的組分,在酵母雙雜交中被廣泛使用。
 
·結論
共鑒定出與油松PtDAL1具有直接相互作用的蛋白質135個,這些蛋白質具有由轉錄因子 (TF)、轉錄調節因子 (TR) 和激酶組成的復雜相互作用網絡,與衰老過程有關;同時,這些蛋白質是響應多種植物激素而產生的環境信號,可能參與木材形成、針葉發育、油樹脂萜類生物合成和生殖發育過程。本文作者提出了一種油松衰老的新調控模型,PtDAL1通過協調環境刺激并與多種重要調控因子產生相互作用,從而調節油松不同年齡段的生長發育,為油松及其它相關針葉樹種年齡調控機制研究提供了科學依據。
 
酵母雙雜交 (Y2H) 與下一代測序 (NGS) 的結合,加大了篩選互作規模的同時提高靈敏度,減輕了實驗數據采集和重復篩選的勞動力成本,為繪制大規模的蛋白互作網絡圖譜提供了可能,給廣大科研學者帶來研究大規模蛋白質互作高效的新思路!
 
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參考文獻!
1. Erffelinck, Marie-Laure, et al. "A user-friendly platform for yeast two-hybrid library screening using next generation sequencing." PLoS One (2018): e0201270.
2. Yang, Jae-Seong, et al. "rec-YnH enables simultaneous many-by-many detection of direct protein–protein and protein–RNA interactions." Nature communications (2018): 1-13.
 
 
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