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高效反轉錄,lncRNA等低拷貝RNA檢測的關鍵
 
RT-qPCR是檢測低拷貝RNA的一種比較實用的技術,RNA拷貝數低,對于檢測靈敏度和準確度的要求非常高。
 
·由于樣本或細胞類型的本身質量問題,或RNA本身表達水平低,感興趣的RNA分子可能以低拷貝數存在。例如,雖然某些組織(如肝臟)每毫克中含有微克數量的RNA,但在其他組織類型中(如骨骼或脂肪),等量的組織中可能含有小于1%的RNA。
·樣本本身是一個限制因素,而冷凍或保存的FFPE組織等樣本可能是不可替代的或非常珍稀寶貴的,因此獲得可靠的RT-qPCR數據至關重要。
·在長期儲存過程中也可能會造成RNA損失。
·調節蛋白如轉錄因子對細胞功能有很強的影響,但也可能在低水平表達。
·還有一些RNA分子如非編碼RNA(pre-miRNA、miRNA、lncRNA等)也可能以低拷貝數存在。
 
使用傳統技術檢測這些目的RNA可能是比較困難的。
 
反轉錄酶的效率是RT-qPCR敏感性的主要限制因素之一。

PrimeScript反轉錄酶的敏感性已被充分證明,例如,根據文獻內容,該酶在total RNA pool中可以檢測到10-21 mol miRNA,同時,該酶的特異性可以區分含有單堿基錯配的miRNA。

 
以下總結了使用PrimeScript反轉錄酶對具有挑戰性的RNA樣本RT-qPCR檢測的文獻。
 
病毒RNA

檢測小鼠肺組織中的甲型流感病毒: Zou, Q., et al. Use of praziquantel as an adjuvant enhances protection and Tc-17 responses to killed H5N1 virus vaccine in mice. PLoS ONE 7, e34865 (2012).

H5N1甲型禽流感病毒具有高致病性,需要更多關于如何誘導廣泛的細胞毒性T淋巴細胞對H5N1滅活疫苗產生反應的信息。文獻報告,吡喹酮(PZQ)佐劑可增強小鼠對H5N1病毒致死劑量攻擊的保護作用。小鼠肺組織中的病毒量檢測使用了One-Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit II (Perfect Real Time)(Code No. RR086)


 
Long non-coding RNA (lncRNA)

PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) 用于分析lncRNA: Mizutani, R., et al. Identification and characterization of novel genotoxic stress-inducible nuclear long noncoding RNAs in mammalian cells. PLoS ONE 7, e34949 (2012).

作者使用生物信息學方法鑒定了可能參與基因毒性應激反應的新lncRNA分子,并使用PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) (Code No. RR036)通過RT-qPCR研究了表達模式。


miRNA and pre-miRNA

PrimeScript Reverse Transcriptase用于檢測10-21mol miRNA: Yao, B., et al Quantitative analysis of zeptomole microRNAs based on isothermal ramification amplification. RNA 15, 1787 (2009).

作者報告開發了一種靈敏且特異的等溫分支擴增(RAM)實時測定法, 用于miRNA的定量分析,無需進一步富集即可準確定量總RNA 樣品中的miRNA。PrimeScript Reverse Transcriptase(Code No. 2680)用于將miRNA初始反轉錄為cDNA。


PrimeScript RT reagent Kit用于分析pre-miRNAs: Tang, Y., et al. Genome-wide analysis reveals diversity of rice intronic miRNAs in sequence structure, biogenesis and function. PLoS ONE 8, e63938 (2013).


雖然大多數 miRNA 位于基因間區域,但有些存在于內含子(in-miRNA)中。作者在水稻中發現了新的in-miRNA分子,并使用PrimeScript RT reagent Kit(Code No. RR037)通過終點法 RT-PCR分析pre-miRNA分子。

 
Frozen or FFPE samples

PrimeScript RT reagent Kit用于分析人子宮肌層與子宮平滑肌瘤(frozen and FFPE samples): Makino, K., et al. Inhibition of uterine sarcoma cell growth through suppression of endogenous tyrosine kinase B signaling. PLoS ONE7, e41049

為了更好地了解子宮平滑肌肉瘤(一種對許多治療方案具有抵抗力的侵襲性腫瘤)的調節作用,作者評估了腦源性神經營養因子(BDNF)和受體酪氨酸激酶B (TrkB)及其配體在子宮組織臨床樣本中的表達。PrimeScript RT reagent Kit(Code No. RR037)用于qRT-PCR分析TrkB 及其配體在子宮肌層和平滑肌瘤的冷凍樣本和平滑肌肉瘤的FFPE樣本中的表達水平。


 
低拷貝mRNA: 轉錄因子

PrimeScript Reverse Transcriptase用于分析轉錄因子的表達: Yamamoto, M., et al. Shared and distinct functions of the transcription factors IRF4 and IRF8 in myeloid cell development. PLoS ONE 6, e25812 (2011).

干擾素調節因子(IRF) 8和IRF4是控制樹突狀細胞和B細胞分化的造血細胞特異性轉錄因子。使用PrimeScript Reverse Transcriptase (Code No. 2680)進行RT-qPCR,作者研究了 IRF4和IRF8本身的表達模式,以及以前已知受IRF8調節的幾個巨噬細胞相關基因。


 
PrimeScript Reverse Transcriptase是一種高靈敏度和高特異性的重組反轉錄酶,不含RNaseH活性,是Takara公司依據M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus)來源的RTase開發的一種反轉錄酶。
Takara在PrimeScript反轉錄酶基礎上設計開發了不同功能的試劑盒,總結如下表。
 
 
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