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無需RNA純化,生物樣本直接qPCR—新冠病毒檢測
 
2019年,Takara發布了無需RNA提取,可直接使用生物樣本進行定量PCR的新產品PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix (or with UNG)(Code No.RR650/651)。該技術不僅引起了分子生物試劑行業的關注,更為大量IVD客戶、醫藥研究人員等帶來了簡便、快速的體驗。尤其在新冠肺炎疫情下,無需RNA提取即可進行新冠病毒核酸檢測,可以大大緩解人力、時間等壓力。
 
 
Takara和各國研究人員已經使用PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix對各種樣本進行了直接qPCR的實驗,成功的檢測結果讓您可以有充足的信心告別繁瑣的RNA提取,進入快速、直接qPCR新時代。
 
實驗例 新冠病毒的直接qPCR檢測
Lübke等科學家在《Journal of Clinical Virology》發表了題為《Extraction-free SARS-CoV-2 detection by rapid RT-qPCR universal for all primary respiratory materials》的文獻,文章中作者以PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix(Code No.RR650)為基礎,研發了無需RNA提取、直接進行新冠病毒qPCR檢測的方法。
 
下面簡要介紹文章中的反應體系和操作流程,實際應用時可能需要用戶進行優化。
 
樣本收集
為了保持反應靈敏度,樣品在4℃下冷凍或儲存時間不得超過7天。本方案適用于所有主要呼吸樣本。
1. 使用Remel Sputasol (Thermo Fisher Scientific)對粘性樣本進行預處理。
2. 將50 μl樣本在99℃下加熱滅活5分鐘。
3. 加熱的樣本4000 rpm離心5分鐘。
4. 向以下反應混合物中添加5 μl上清液。
 
反應體系
可以先配制不含樣本的反應試劑master mix,分裝為20 μl/rxn,冷凍保存,在一周內使用。
組分 液量(μl)
  PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix (2X) 12.5 μl
  Forward Primer 終濃度400 nM
  Reverse Primer 終濃度400 nM
  qPCR probe 終濃度200 nM
  Viral PBS sample 5 μl
  RNase Free H2O Fill to 25 μl
  Total 25 μl
 
新冠病毒檢測用引物和探針,使用乙型肝炎S抗原基因作為內對照
Name 目的基因 序列 反應液終濃度
 CoV-E-F  E gene  CTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCT 400 nM
 CoV-E-R  E gene  TACAAGACTCACGTTAACAATATTGCA 400 nM
 CoV-E-Pr  E gene  FAM-CTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTG-BHQ 200 nM
 HBV-Taq1  HBV-SynQ*  CAACCTCCAATCACTCACCAAC 200 nM
 HBV-Taq2  HBV-SynQ*  ATATGATAAAACGCGCAGACAC 200 nM
 HBV-IC  HBV-SynQ*  Cy5-CTGCCGAGCTCTGACTA-BHQ 200 nM
*HBV-SynQ (internal control): 合成的質粒,編碼失活的乙型肝炎S抗原。
 
反應條件
  90℃   30 sec   變性(粗提·核酸純化)
  60℃   5 min   反轉錄
  PCR循環圈數: 45
  95℃   5 sec   變性
  60℃   30 sec   退火/延伸
 
結論
作者使用上述方法,對于常規方法Ct值<35的樣本的直接qPCR檢出率為95.8%,對于全部樣本(Ct值較高、保存時間較長)的直接qPCR檢出率為81.3%。
該方法具有靈活、快速的特點,可在一個小時內完成對于新冠病毒核酸的qPCR檢測。
 
作者簡介
Dr. Nadine Lübke是醫學專家病毒學家,也是德國杜塞爾多夫大學病毒研究所的基因分型和抗性測試負責人。她專注于研究對HIV的抗病毒治療的抗性,最近獲得了德國抗病毒病協會(DVV)和病毒學會(GfV)頒發的2019年臨床病毒學科學獎。除了在艾滋病毒抗性測試領域的多年臨床和科學工作外,Dr. Nadine Lübke還運用她的專業知識來幫助抗擊COVID-19大流行。
 
您可以點擊webinar鏈接,由Dr. Nadine Lübke為您詳細介紹她的團隊如何開發出這種簡便快速的RT-qPCR檢測方法來直接檢測SARS-CoV-2,而不需要提取RNA。
 
杜塞爾多夫醫院目前正在使用這種檢測方法,在與感染患者接觸的醫生和工作人員中頻繁地篩查COVID-19,這對于防止感染的局部傳播至關重要。
 
 
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