我們使用cookie改善您的瀏覽體驗并提供有意義的內容。請閱讀我們的cookie協議
收藏我們 在線訂購
     

機構用戶解決方案

產品選擇指南

技術服務信息

當前位置:首頁 > 新聞中心
無需RNA純化,生物樣本直接qPCR—多種病原菌檢測實例
 
2019年,Takara發布了無需RNA提取,可直接使用生物樣本進行定量PCR的新產品PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix (or with UNG)(Code No.RR650/651)。
 
 
點擊鏈接,了解德國科學家使用RR650構建不需要RNA提取的快速新冠病毒qPCR檢測新方法。
 
下面介紹一下使用直接qPCR方法進行甲流病毒、金黃葡萄球菌、寨卡病毒檢測的實驗例。
 
實驗例1 甲型H1N1流感滅活病毒的檢測
我們使用PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix直接對生物樣本進行H1N1檢測。
 
實驗樣本
將滅活甲型流感病毒以2×100-102 copies/μl的濃度加入口腔拭子樣本、鼻拭子樣本和唾液樣本中。
 
檢測樣本 說明
口拭子   將取樣的口拭子浸泡在200 μl PBS緩沖液中,搖勻5秒,然后向反應液中添加1 μl上清液。
鼻腔拭子   將取樣的鼻腔拭子浸泡在200 μl PBS緩沖液中,搖勻5秒,然后向反應液中添加1 μl上清液。
唾液   直接向反應液中添加1 μl上清液。
 
反應體系
組分 液量(μl)
  PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix (2X) 12.5 μl
  Forward Primer (10 μM) 0.5 μl
  Reverse Primer (10 μM) 0.5 μl
  qPCR probe (10 μM) 0.5 μl
  樣本 1 μl
  甲型流感病毒H1N1 (2×100-102 copies/μl) 1 μl
  RNase Free H2O 9 μl
  Total 25 μl
 
反應結果
擴增曲線如下圖,鼻腔拭子和唾液樣本的檢測靈敏度為20拷貝,口腔拭子樣本的檢測靈敏度為2拷貝。
 
實驗例2 全血中的金黃葡萄球菌檢測
 
實驗樣本
全血(肝素血及EDTA血)及其10倍稀釋液(PBS)中加入1×101~105 cfu/μl濃度的金黃葡萄球菌。制備好后各使用1 μl。
 
引物/探針檢出范圍: 16S rRNA基因(Cy5標記)
 
反應體系
組分 液量(μl)
  PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix, with UNG (2X) 25 μl
  Forward Primer (10 μM) 1 μl
  Reverse Primer (10 μM) 1 μl
  TaKaRa qPCR Probe (10 μM) 1 μl
  血液樣品(含金黃葡萄球菌) 1 μl
  RNase Free H2O 21 μl
  Total 50 μl
 
反應條件
  90℃   3 min  
  60℃   5 min  
  95℃   5 sec 40 Cycles
  60℃   30 sec
 
結論
雖然使用血液成分進行檢出時有阻害,但是PrimeDirect Mix在全血原液中(肝素血、EDTA血)可直接檢出100 cfu,其10倍稀釋液也可以直接檢出10 cfu的金黃葡萄球菌。該實驗顯示,1 μl全血中如果存在100 cfu的金黃葡萄球菌,可以檢出。
 
實驗例3 Zika(寨卡)病毒檢測
 
實驗樣本
在尿液及其10倍稀釋液(生理鹽水)中,加入2×103 copies/μl濃度的NATtrol Zika Virus(ZeptoMetrix公司)制備起始樣品,然后各使用1 μl。
 
引物/探針檢出范圍: Polyprotein基因(ROX標記)
 
組分 液量(μl)
  PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix, with UNG (2X) 12.5 μl
  Forward Primer (10 μM) 0.5 μl
  Reverse Primer (10 μM) 0.5 μl
  TaKaRa qPCR Probe (10 μM) 0.5 μl
  尿液樣品(含Zika virus) 1 μl
  RNase Free H2O 10 μl
  Total 25 μl
 
反應條件
  90℃   3 min  
  56℃   5 min  
  95℃   5 sec 40 Cycles
  56℃   30 sec
 
結論
PrimeDirect Mix不易受尿原液的阻害,可直接檢出尿液中的Zika病毒。
 
檢測靈敏度
尿原液中分別添加濃度為2×10-2~103 copies/μl NATtrol Zika Virus制備起始樣品,各使用1 μl,使用上面相同的反應體系和反應條件。
 
PrimeDirect Mix不易受尿液阻害,尿液中的Zika病毒2個拷貝以上即可檢出。
感染者的尿液中該病毒RNA濃度為2.1x10 copies/μl的案例也有報道,使用本試劑能夠滿足檢出靈敏度。
Zika 病毒感染者尿液中病毒RNA濃度的案例:(https://www.niid.go.jp/niid/ja/id/2358-disease-based/sa/zika-fever/7169-zikara-11-170331.html)
 
我們對全血中Zika病毒檢測,也得到了類似結論。
血液成分對檢出雖然有阻害作用,但全血10倍稀釋液中的Zika病毒2拷貝以上可以檢出。顯示出在全血原液1 μl中存在20拷貝左右的Zika病毒時,可以檢出。
 

 
眾多實驗例充分證明,PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix (or with UNG)(Code No.RR650/651)在直接qPCR檢測方面有著良好的表現,血液、尿液、糞便、細胞可以直接進行病毒或細菌的一步法RT-qPCR,大大提高了操作簡便性,減少了反應時間,可以簡便、低成本地進行qPCR檢測。
另外,Takara基于至今為止積累的技術和經驗,提供使用本產品制造基因檢測kit的定制生產,提供更適合的Real Time PCR檢測試劑。
 
從基因分析領域的基礎研究到產業應用,Takara將持續不斷推出各種用途的新產品和服務,從而進一步擴大生物產業支援事業。
 
 
 
欧美暴力交xxxx,亚洲区欧美区小说区在线,欧美牲交videossexeso,欧美亚洲国产片在线播放